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Diagnóstico do Coronavírus

Para realizar o diagnóstico do Coronavírus, é necessário realizar alguns procedimentos com expertise suficiente, a fim de não haver contaminação do profissional da saúde ou da amostra.

O primeiro passo para o diagnóstico do Coronavírus é coletar uma amostra, usando um bastão de plástico macio e estéril, os profissionais de saúde limpam o interior do nariz ou a parte posterior da garganta do paciente. O objetivo é coletar material recentemente presente nos pulmões, onde se acredita que o vírus se replique. Esse bastão é selado e enviado em um recipiente frio para o laboratório.  A amostra deve permanecer entre 35 e 40 graus Fahrenheit e, se não for processada dentro de quatro dias, ela entra no congelador ou é jogada fora.

Uma vez em um laboratório, o primeiro passo é separar o RNA de todo o resto da amostra – células humanas, proteínas, enzimas que podem digerir esse código genético viral caso não sejam removidas. Isso é chamado de extração de RNA. Se você estiver fazendo isso manualmente, esse processo geralmente envolve a adição de produtos químicos e a centrifugação da amostra, para que o RNA termine em uma camada diferente de todo o resto. Vários grandes fornecedores bioquímicos fazem kits com tudo o que você precisa para a extração de RNA. Também existem máquinas automatizadas que fazem isso. Lembre, quanto menor for a manipulação da amostra, melhor!

Uma vez que o RNA tenha sido purificado, o próximo passo é adicionar a enzima transcriptase reversa que o converte em DNA – passando de uma cadeia para duas. Em seguida, o DNA entra em um tubo de ensaio junto com nucleotídeos soltos, uma enzima de construção do DNA, conhecida como DNA polimerase, e pequenos fragmentos de DNA sintetizados chamados “primers”. Esses iniciadores foram projetados para encontrar e se ligar a segmentos específicos do genoma viral. Em outras palavras, eles devem, se funcionarem corretamente, reconhecer e amplificar apenas o material genético do vírus, e não de qualquer outra coisa que possa estar na amostra, como DNA humano ou bacteriano.

Tudo isso acontece dentro de uma máquina de PCR, um instrumento que executa ciclos coordenados de temperatura. À medida que o tubo aquece, a dupla hélice do DNA se separa em dois, expondo cada lado. Quando, posteriormente, a temperatura diminui, os primers se prendem aos segmentos direcionados do DNA exposto. A enzima usa esses iniciadores como ponto de partida e começa a construir filamentos complementares de DNA de acordo com a sequência exposta. Alguns segundos depois, onde antes havia uma fita de DNA, agora existem duas. Após 30 a 40 ciclos desse processo, uma única cópia do DNA se multiplica para centenas de milhões. Isso é DNA suficiente para que os cientistas possam começar a detectá-lo.

Eles fazem isso com um corante fluorescente que é adicionado ao tubo de ensaio durante a fase de amplificação por PCR. Apenas brilha na presença de DNA. À medida que o número de cópias do DNA aumenta, aumenta também a quantidade de luz emitida. Um instrumento especial de medição de luz dentro da máquina de PCR lê esses padrões de fluorescência para determinar quais amostras contêm o vírus e quais não. Se houver coronavírus em sua amostra, seu RNA será transcrito para o DNA e amplificado junto com um sinal fluorescente que informa se o teste é positivo ou negativo.

O que é importante lembrar sobre o RT-PCR é que não é um teste para um vírus. É um método para identificar sequências genéticas específicas usadas em laboratórios acadêmicos, comerciais e de saúde pública em todo o mundo. E a receita exata que os cientistas seguem para obter resultados confiáveis ​​- qual kit de extração de RNA, qual máquina de PCR, quais primers – podem variar. Essas receitas são chamadas de “protocolos”.

Quando uma doença nova como o Covid-19 surge, universidades, institutos nacionais de pesquisa e organizações de saúde pública como o Centro de Prevenção e Controle de Doenças dos EUA são geralmente os primeiros a produzir protocolos de RT-PCR. Eles têm laboratórios de biossegurança para lidar com novos patógenos mortais, incluindo a capacidade de cultivá-los – uma etapa crucial para validar qualquer teste. Depois que essas agências tiverem um teste de trabalho, elas poderão implantá-lo em laboratórios e hospitais públicos locais de saúde. Eventualmente, se o surto persistir, laboratórios comerciais e empresas de diagnóstico produzirão seus próprios testes, que podem ou não exigir a mesma quantidade de experiência e trabalho manual em laboratório.

A partir de janeiro, logo após os pesquisadores chineses lançarem a primeira sequência genômica completa do SARS-CoV-2, grupos em todo o mundo começaram a projetar, testar e publicar publicamente protocolos para detectar o novo coronavírus com RT-PCR. Como recurso para laboratórios de teste, a Organização Mundial da Saúde mantém uma lista desses protocolos, bem como diretrizes para as melhores práticas.

Entre eles está um protocolo para o diagnóstico do Coronavírus desenvolvido pelos Centros de Prevenção e Controle de Doenças dos EUA. Seu teste consiste em quatro conjuntos de primers. Os dois primeiros, chamados N1 e N2, têm como alvo regiões únicas do genoma SARS-CoV-2 que codificam uma proteína que encapsula e protege o material genético do vírus. O terceiro iniciador tem como alvo um gene comum a toda a família de vírus do tipo SARS. O quarto e final iniciador tem como alvo um gene humano, que serve como um controle de qualidade. Os kits também incluem instruções para testar um controle negativo – DNA que não está relacionado ao SARS-CoV-2 – que não deve reagir com os três primeiros iniciadores.

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Biologia Molecular e sua Aplicação no Diagnóstico de Doenças Infecciosas e Parasitárias

24 de março de 2020
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