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O que é Espectrometria de Massas?

A espectrometria de massa é um método poderoso para analisar macromoléculas.

Embora a técnica de espectrometria de massa ainda é muito usada para identificação de compostos ou peptídeos, abordagens recentes estão mais focadas na análise direcionada de conjuntos de dados maiores.

Essa técnica pode ser dividida em 3 etapas:

  1. Preparação da amostra:

Esse método está entre os mais sensíveis métodos utilizados na detecção de proteínas, sendo capaz de detectar proteínas no intervalo Femto (10−15).

Situações que requerem monitoramento e validação:

 – Baixa concentração de proteína intracelular;

– Proteína propensa à degradação ou está localizada no compartimento intracelular;

– Proteínas citosólicas mais abundantes podem mascarar o sinal da proteína de interesse.

O Experimento pode ser monitorado por SDS – PAGE, ou preferencialmente por Western blot.

No estudo de proteínas pouco expressas pode realizar a imunoprecipitação ou fracionamento celular.

  1. Purificação da amostra

Digestão enzimática

Após redução e alquilação, as proteínas devem ser digeridas em peptídeos do tamanho certo compreendendo de 8 a 15 aminoácidos.

A enzima mais utilizada na digestão é a tripsina. Porém, se houver locais poucos locais de reconhecimento da tripsina ou em excesso, outras proteases podem ser usadas para gerar uma faixa mais adequada de peptídeos.

Os comprimentos de peptídeos após a digestão podem ser previstos on-line com o software PeptideMass – https://web.expasy.org/peptide_mass/ .

Digestão em gel ou em solução

As proteínas podem ser digeridas diretamente em solução ou depois de serem executadas em gel, seguida pela extração dos peptídeos digeridos.

Em solução

Vantagem

Nenhuma perda de material da amostra

Desvantagem

O tampão deve ser compatível com a digestão com tripsina

O tampão pode ser incompatível com o reagente de quantificação de proteína

O tampão pode ser incompatível com o tipo de equipamento que será realizada a análise

 

Em gel

Vantagem

Etapa de limpeza adicional para evitar contaminantes como polímeros; Separação adicional de proteínas de acordo com seus tamanhos, cortando a faixa em diferentes frações.

Desvantagem

Perda de material da amostra.

  1. Análise de dados

Utilize um banco de dados de proteínas apropriado para seu experimento e organismo na UniProt ( https://www.uniprot.org ) e carregue a versão mais recente no seu software de especificação MASS.

 

Crédito da imagem: Daniel Norena-Caro, 2017

Referência:

1 – The value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics

Danielle L. Swaney, Craig D. Wenger, and Joshua J. Coon.  J Proteome Res. 2010 Mar 5; 9(3): 1323–1329.

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